El trabajo por turnos se define como el que excede las horas laborales diurnas convencionales (cerca de las 7 u 8 a.m. hasta las 5 o 6 p.m.) e incluye turnos de noche, madrugada y trabajo rotativo [1]. La Unión Europea ha reportado un incremento de los trabajadores por turnos que representan hasta el 21% de la fuerza laboral [2]. En Colombia, según la Encuesta Nacional de Condiciones de Seguridad y Salud en el Trabajo, en 2007 el 29%de los trabajadores realizaba turnos rotativos de los cuales, 68% eran hombres y 32% eran mujeres [3].

Recientes meta análisis han registrado un riesgo mayor de padecer obesidad y diabetes en los trabajadores por turnos [4,5]. Además, se han reportado variaciones en las concentraciones de melatonina en este grupo de trabajadores, como disminución de los niveles nocturnos de melatonina o aumento de los niveles diurnos [6,7,8,9,10].

Se ha demostrado que la alternancia de luz y oscuridad sincroniza el reloj interno que determina el ciclo circadiano, capacidad que en cronobiología recibe el término zeitgeber [11]. La síntesis de melatonina se relaciona con el ciclo luz y oscuridad. Esta hormona es secreta- da por la glándula pineal en las horas oscuras y su producción es inhibida rápidamente por la luz. La luz ambiental es percibida por la retina, actuando principalmente en un subgrupo de células ganglionares que contienen melanopsina, y que comunican la información al núcleo supraquiasmático el cual coordina la función de la glándula pineal, regulando la secreción de melatonina [12,13]. Los valores circulantes de esta hormona tienen un patrón marcado de secreción, se incrementan generalmente entre las 9 a 10 de la noche, alcanzan su pico entre las 2 a 4 de la madrugada, descienden en la mañana alrededor de las 7:00 a 9:00 a.m. y mantienen una mínima concentración entre el mediodía y las 7:00 p.m. [14,15]. Investigaciones previas muestran que los niveles circulantes de melatonina presentan gran heterogeneidad entre sujetos, sin embargo, son muy reproducibles día a día en un mismo individuo y representan uno de los ritmos circadianos más robustos; no se ha encontrado hasta el momento algún polimorfismo de enzimas que explique esta heterogeneidad [16].

El núcleo supraquiasmático, además de controlar la secreción de melatonina, es el principal centro regulador de los ritmos circadianos, por lo cual regula múltiples acciones endocrinas y fisiológicas [17]. Existe evidencia de que la melatonina ejerce una retroalimentación al núcleo supraquiasmático influenciando los mecanismos circadianos [18]. Se ha demostrado en modelos animales pinealectomizados que la ausencia de melatonina conduce a resistencia a la leptina y sobrepeso, así como, intolerancia a la glucosa e insulinorresistencia [19,20]. En sujetos que trabajan por turnos, con cambios en su exposición al ciclo luz y oscuridad, se han documentado modificaciones en las concentraciones circulantes de melatonina [6,21], así como, alteraciones en los niveles de glucemia [22,23] y en la in- gesta de alimentos [24,25,26]. La relación entre melatonina y diabetes ha recibido gran atención en los últimos años ya que la melatonina se ha relacionado con una mayor señalización intracelular de la insulina [27].

Estudios de cohortes del gen MTNR1B que codifica el receptor de melatonina 1B han demostrado en humanos la presencia de un polimorfismo que se asocia a fenotipos con alteraciones en la secreción de melatonina, aumento de la glucemia en ayunas, disminución de la función de las células beta pancreáticas (determinada por índice HOMA beta) y mayor riesgo de diabetes mellitus tipo 2 [28,29] .

La leptina hormona secretada principalmente por los adipocitos blancos suprime el apetito [30]. Sin embargo, llama la atención que, en varios estudios, los sujetos con niveles elevados de esta hormona presentan un mayor riesgo de desarrollar síndrome metabólico independiente de su peso [31,32]. La leptina muestra una secreción circadiana y poco se conoce de la relación de sus niveles circulantes con el traba- jo por turnos [15]. En hombres, se han descrito valores promedio de leptina circulante de 5,2 ng/mL y de 8,1 ng/mL de los 18 a los 44 años y de los 45 a los 64 años respectivamente [33].

Teniendo en consideración el mayor riesgo documentado de los trabajadores por turnos de padecer obesidad y diabetes, así como, la relación entre la melatonina con la regulación de la glucemia en humanos y con el sobrepeso y los cambios en los niveles de leptina en modelos animales, se ha propuesto la hipótesis de una posible relación entre los niveles de melatonina del trabajador por turnos con variaciones en la ingesta de alimentos, concentraciones circulantes de leptina y glucemia.

Por ello, la presente investigación pretende determinar si existen cambios de los niveles salivales de melatonina, la ingesta de alimentos, las concentraciones séricas de leptina, insulina, glucosa y el índice de resistencia a la insulina determinado por análisis del modelo homeostático (HOMA-IR) después de siete noches de trabajo nocturno, en un grupo de hombres vigilantes, así como, estimar posibles correlaciones entre las variables estudiadas.

Muestra de estudio

Se realizó un estudio exploratorio de tipo descriptivo comparativo; la población se seleccionó por medio de un muestreo no probabilístico por conveniencia, el universo estuvo conformado por el personal de la División de Vigilancia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá DC, a quienes se les realizó una convocatoria abierta, en donde se socializó el proyecto de investigación a 200 tra- bajadores. De ellos, 56 trabajadores por turnos expresaron su interés en participar y posteriormente se entrevistaron de manera telefónica; el porcentaje de trabajadoras de sexo femenino correspondió únicamente al 15% del total de los voluntarios, por lo cual se incluyeron sólo participantes del sexo masculino.

Los trabajadores entrevistados cumplían distintos horarios de rotación laboral; el más reportado fue el de semana – semana, en el que laboraban 7 turnos nocturnos (primera semana) proseguidos por 2 días de descanso y 5 turnos diurnos (segunda semana); esta rotación semana – semana fue escogida como horario de estudio para esta investigación por contar con un mayor número de trabajadores lo que permitía mayor uniformidad de los horarios. Respecto a los criterios de inclusión y exclusión se incluyó a hombres sanos, mayores de edad, que tuvieran un vínculo laboral vigente con la División de Vigilancia de la Universidad Nacional y rotaran en un horario semana – semana. Se excluyó a quienes consumían suplementos de melatonina, personas con diabetes o pre- diabetes diagnosticadas, enfermedad renal y consumo de medicamentos para dormir.

Se citaron 16 participantes que cumplían con el tipo de rotación seleccionado y los criterios de exclusión. De ellos, 12 firmaron el consentimiento informado y dos revocaron el consentimiento en el transcurso de la investigación, por lo cual, este estudio exploratorio se realizó con 10 sujetos sanos de sexo masculino entre 18 y 55 años.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se utilizaron los programas IBM SPSS™ (IBM SPSS Statistics 2016 versión 24.0 Chicago) y R™ (GNU project 2017 versión 3.5.1.). Cada variable fue caracterizada por la mediana y los percentiles 25 y 75; también se determinó el promedio y el área bajo la curva de melatonina (AUC por sus siglas en inglés). Dada la cantidad de datos y el tamaño de la población se utilizó estadística no paramétrica. Las diferencias entre las varia- bles se valoraron por medio de prueba de los rangos con signo de Wilcoxon para descartar la igualdad de los rangos medios y establecer si hubo un cambio significativo en las variables después del turno nocturno. Por su parte, las correlaciones se llevaron a cabo a partir del coeficiente de correlación de Spearman y se calculó el p valor bilateral. Para todos los análisis el nivel de significancia fue de p<0,05.

Diseño del estudio

Los participantes cumplieron una rotación laboral de siete turnos nocturnos, en horario de 10 p.m. a 6 a.m., dos días de descanso y retomaron nuevamente el trabajo para cumplir cinco turnos diurnos, en horario de 6 a.m. a 3 p.m., al cabo de los cuales comienzan de nuevo la rotación laboral. Durante los catorce días del protocolo (Figura 1) se verificó que los voluntarios cumplieran con su horario de trabajo sin presentar incapacidades o permisos.

Figura 1 Figura 1 Esquema del protocolo de investigación elaboración propia.

El primer día los participantes firmaron el consentimiento informado y se les tomaron medidas antropométricas. Se registraron los alimentos consumidos durante el último día del turno nocturno y el penúltimo día del turno diurno. Los trabajadores iniciaron su último turno nocturno a las 10 p.m. del día siete y lo terminaron a las 6 a.m. del día ocho, ese día a las 7 a.m. en ayunas y en su lugar de trabajo se les tomó una muestra de sangre y una muestra de saliva; después, ya en sus hogares, recogieron muestras de saliva a la 1 p.m., 9 p.m. y 2 a.m.

De igual forma, el día catorce que corresponde al último turno diurno, los trabajadores llegaron en ayunas a iniciar sus labores a las 6 a.m., se ubicaron en sus puestos de trabajo y se recolectó una muestra de sangre y una muestra de saliva a las 7 a.m.; luego, en sus hogares, recogieron muestras de saliva a la 1 p.m., 9 p.m. y 2 a.m.

Muestras de sangre

Después de un ayuno de mínimo 8 horas se obtuvieron muestras de sangre de la vena cubital en tubos tapa amarilla con gel, utilizando el sistema venoject. Las muestras fueron centrifugadas (2500 r.p.m) y los sueros obtenidos se almacenaron en contenedores de polipropileno de 1,5 ml a -20°C hasta la determinación de leptina por el método de microelisa (ELISA kit LDN®), glucosa por técnica colorimétrica (ROCHE Diagnostics®) e insulina por electroquimioluminiscencia (ROCHE Diagnostics®).

A partir de las concentraciones de glucosa e insulina basales, se utilizó el análisis del modelo homeostático para calcular el índice de resistencia a la insulina según la fórmula HOMA-IR= (glucemia (mg/dL)/ 18 X insulina (microU/mL)/22,5). Así como, el índice HOMA-B%, que evalúa el funcionamiento de las células beta pancreáticas, según la fórmula HOMA-B% = (360 X insulina (microU/mL)) / (glucosa (mg/ dL) - 63). En un individuo sano, con un índice de masa corporal (IMC) normal y sin antecedentes familiares de diabetes mellitus, se considera que el HOMA-B% se encuentra alrededor del 100% y el HOMA-IR es cercano a 1 [34].

Muestras de saliva

Las muestras de saliva se tomaron el último día del turno diurno y el día de descanso después de terminar siete noches de turno nocturno. En ambos casos, las tomas de muestras se llevaron a cabo a las 7:00 am (en ayunas), 1:00 pm, 9:00 pm y 2:00 am. Estos puntos de tiempo se escogieron teniendo en cuenta los horarios reportados sobre el patrón circadiano de secreción de melatonina, con el fin de, registrar concentraciones cercanas a los momentos de aumento, pico máximo y valores mínimos de melatonina. Los niveles circulantes de melatonina presentan gran heterogeneidad entre sujetos, sin embargo, son muy reproducibles día a día en un mismo individuo [16].

Se dieron instrucciones escritas para recordarles los horarios de toma de muestras y se describió el paso a paso para obtener las muestras de saliva no estimulada. Se solicitó no haber comido, masticado chicle, fumado ni haberse lavado los dientes 30 minutos antes de tomar la muestra, así como no haber aplicado ningún tipo de bálsamo labial en el momento de la misma. Se suministraron datos de con- tacto para atender cualquier inquietud sobre el proceso, y se supervisó la toma de la primera muestra de cada día. La saliva fue depositada por los participantes con ayuda de una pajilla en contenedores previamente rotulados específicos para la cuantificación de melatonina (salicaps IBL®). A los participantes se les suministró un contenedor temperado para guardar las muestras y posteriormente, éste se recogió en la vivienda de cada uno.

Las muestras se congelaron a -70°C hasta el momento del análisis. Previo al análisis estuvieron a temperatura ambiente, centrifugadas (6000 r.p.m) y divididas en alícuotas para la determinación por duplicado de los niveles de melatonina mediante la técnica de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) a partir del kit Melatonin saliva ELISA IBL®, con un rango de detección entre 1,0 - 50 pg/ ml; posteriormente se leyó la placa a 450 nm en una ventana de tiempo de 15 minutos y se calcularon las concentraciones a partir de la gráfica semilogaritmica de las densidades ópticas y las concentraciones conocidas.

Antropometría

Se obtuvieron datos antropométricos de cada sujeto una sola vez al inicio de la investigación; se utilizó una balanza marca Omron™ HBF-510 calibrada con analizador de la composición corporal por impedanciometria, tallímetro de pared y cinta métrica no extensible; las mediciones antropométricas se realizaron por una nutricionista de acuerdo al protocolo ISAK [35]. Los datos obtenidos fueron:

Edad, por fecha de nacimiento (años cumplidos).

Recordatorio de 24 horas y análisis de los componentes alimentarios

La valoración de la ingesta la realizó una nutricionista a partir del cuestionario dietéticorecordatorio de 24 horas realizado en dos ocasiones a cada paciente. El cuestionario pretende obtener una descripción detallada de los alimentos ingeridos el día anterior. Los cuestionarios se aplicaron al finalizar el turno nocturno y el último día de turno diurno. Esto resulta en el registro de los alimentos consumidos durante un turno diurno y un turno nocturno de cada paciente.

Para su análisis, la información obtenida se agrupó según el turno y el tiempo de comida; los tiempos de comida desayuno, almuerzo y cena, fueron los que el paciente refirió en el cuestionario. Los alimentos adicionales se ubicaron en otro grupo denominado “entre tiempos”, ya que no tenían una distribución temporal homogénea. A continuación la información se procesó en la herramienta informática Menús Plus™ (Comunidad web Ltda. 2017 Versión 7.2017.11. Bogotá) para obtener los gramos de proteínas, grasas, carbohidratos, kilocalorías totales y kilocalorías por tiempo de comida consumidos en ambos turnos.

Consideraciones éticas

La presente investigación se apegó a los principios éticos de la Declaración de Helsinki y de la normativa dictada por el Ministerio de Salud de la República de Colombia en la resolución número 8430 de 1993, y fue aprobada por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia mediante acta de evaluación número 002-011-17. La totalidad de la población involucrada expresó su voluntad de participar al firmar el consentimiento informado.

Caracterización de la muestra de estudio

La muestra del estudio estaba conformada por 10 sujetos sanos de sexo masculino (Tabla 1). Dos de los participantes eran fumadores activos, con un consumo de 5 y 10 cigarrillos al día, respectivamente. Un sujeto reportó tener problemas para conciliar el sueño, aunque no tomaba medicamentos de ningún tipo.

Tabla 1

P25: percentil 25. P75: percentil 75

En la presente investigación se observó que las concentraciones de melatonina después del turno nocturno no presentan un descenso tan importante hacia el medio día como el observado durante el turno diurno, lo que concuerda con los resultados obtenidos en otras investigaciones donde se describe mayor melatonina diurna en los trabajadores con este tipo de horario [8,9]. Eckel et al. observaron que los niveles de melatonina eran mayores y persistían más tiempo elevados en las personas sometidas a una disminución en las horas de sueño. Adicionalmente, describieron una asociación significativa a partir de un modelo lineal combinado entre los niveles de melatonina que permanecían elevados durante más tiempo y una menor sensibilidad a la insulina [37].

Se han descrito efectos de la melatonina en el aumento de la somnolencia y disminución del estado de alerta, lo que podría afectar el rendimiento de los trabajadores [38]. Sin embargo, los efectos de la melatonina aumentada durante horas diurnas, no han sido suficiente- mente explorados.

Por otra parte, se han descrito niveles menores de melatonina nocturna en los sujetos que laboran por turnos, en comparación con grupos control de trabajadores diurnos [6,7,21,39,40]. Es de resaltar que los niveles de melatonina en las personas con este tipo de horario pueden permanecer alterados por varios días después de laborar en turnos nocturnos. En algunas investigaciones los niveles de melatonina de los trabajadores por turnos fueron inferiores a los de los trabajadores diurnos, incluso en la primera y segunda noche durmiendo en casa después de ejecutada la rotación nocturna [41,42]. Los resultados de la presente investigación, sobre los cambios de melatonina en el mismo sujeto, concuerdan al hallar diferencias en el perfil de melatonina de los participantes después del turno nocturno incluso al dormir en su casa el día libre.

Se pudo establecer que la glucemia al finalizar el turno nocturno fue mayor que la observada en el turno diurno, lo que coincide con investigaciones que han descrito mayor glucemia basal en los trabajadores nocturnos que en sus pares diurnos [22,23]. Morris et al. compararon la glucemia posprandial de trabajadores por turnos en respuesta a comidas isocalóricas idénticas brindadas en dos momentos, una durante un turno diurno simulado (protocolo de alineación circadiana) y otro en un turno nocturno simulado (protocolo de desalineación circadiana), encontrando un aumento significativo de la glucosa posprandial en el turno nocturno simulado a pesar de ser comidas isocalóricas idénticas. Lo anterior sugiere que esta variación diferente de la glucemia está relacionada con una respuesta al ciclo de luz y oscuridad [43]. Investigaciones han demostrado que los islotes pancreáticos presentan un ritmo circadiano de secreción de insulina independiente de las concentraciones de glucosa y que la capacidad de respuesta de las células beta a la glucosa es regulada por el ciclo luz – oscuridad [44,45]. Asimismo, estudios experimentales demostraron que la melatonina promueve la fosforilación de algunas tirosinas del receptor de insulina aumentando la acción biológica de la insulina [27].

Además, no se observó un aumento significativo de la concentración de insulina como se esperaba para el incremento de la glucemia; al contrario, el valor del índice HOMA-B% observado sugiere una tendencia a la reducción de la función beta pancreática después de siete noches de turno nocturno. Por otra parte, no se evidenció una mayor resistencia a la insulina a partir del índice HOMA-IR al comparar ambos turnos; a diferencia de este hallazgo, las investigaciones que realizan la comparación con trabajadores fijos diurnos han reportado mayor resistencia a la insulina en personas que trabajan por turnos [46,47]. Esta diferencia podría obedecer al tipo de metodología empleada, ya que, el presente estudio compara el mismo sujeto durante el turno diurno e inmediatamente después del turno nocturno, en contraste con los otros estudios que determinan diferencias entre distintos sujetos. Adicionalmente, no se establecieron correlaciones significativas entre los niveles de melatonina, con los de glucosa, insulina o el índice HOMA-IR.

Además, en la presente investigación se observó que los trabajadores ingirieron mayor cantidad de calorías durante el turno nocturno, lo que concuerda con estudios que reportan un aumento de la ingesta de calorías en los trabajadores por turnos en comparación a los trabajadores diurnos [24,25,26]. Los mecanismos por los cuales se produce el aumento en la in- gesta energética no han sido elucidados. Qian et al. realizaron un estudio en el que invirtieron las horas de luz y oscuridad en un grupo de sujetos, demostrando bajo esta circunstancia una elevación en los niveles circulantes de ghrelina, hormona relacionada con el estímulo del apetito. Este incremento no se relacionó con las puntuaciones de hambre y, no obstante, se observó un aumento del apetito por alimentos densamente energéticos [48]. Cedernaes et al. observaron por medio de pruebas psicológicas y estudios electroencefalográficos, que en sujetos de peso normal privados de sueño se reduce la capacidad de ejercer inhibición cognitiva hacia los estímulos alimentarios [49]. El desbalance entre ingesta calórica y gasto energético puede llevar a un aumento de peso y a la obesidad. Se ha reportado una disminución del gasto energético en reposo y posprandial a través de calorimetría indirecta en sujetos privados del sueño [50].

Por otra parte, la leptina interviene en el control neurohormonal de la ingesta suprimiendo el apetito [30] pero no se ha podido establecer claramente el comportamiento de esta hormona durante el trabajo nocturno. Esta investigación encontró mayor ingesta energética durante el turno nocturno y a pesar de ello, niveles de leptina significativamente mayores al finalizar la rotación nocturna. La simulación de trabajo nocturno en individuos no trabajadores por turnos ha mostrado una disminución de la leptina con respecto a la línea de base [51], mientras que, al comparar trabajadores con un historial de al menos dos años de trabajo por turnos con trabajadores fijos diurnos, se han observado mayores valores de leptina en los trabajadores por turnos [52], lo que coincide con lo encontrado en la presente investigación. Se ha descrito que la concentración de leptina puede variar como respuesta a cambios en la ingesta alimentaria [53,54], como los ocurridos durante esta investigación. Estudios de cohortes han establecido una asociación significativa entre niveles mayores de leptina y un aumento en el riesgo de padecer síndrome metabólico incluso después de ajustar el resultado al IMC [31,32,55,56,57,58].

Se constató una relación negativa entre melatonina basal y leptina, resultados acordes con la relación inversa entre estas hormonas reportadas en investigaciones en modelos animales [59]. En ratas pinealectomizadas se detectó un aumento de la producción de leptina, que fue revertido al administrar melatonina exógena [60]. Por otro lado, en células pineales de ratas Wistar, la leptina ejerce un efecto inhibitorio de la producción de melatonina al parecer mediado por una disminución de la actividad y expresión de la arilalquilamina N- acetiltransferasa (AANAT), enzima fundamental para la síntesis de melatonina [61]. Otros estudios en ratas Wistar han mostrado que la ausencia de melatonina conduce a sobrepeso y resistencia a la leptina a largo plazo [20].

En esta investigación se encontraron relaciones negativas de las concentraciones de melatonina con la circunferencia de cintura y la grasa visceral; mientras que se encontró una relación positiva con la masa muscular. Se ha descrito que la melatonina regula los cambios estacionales en la adiposidad de animales que son fundamentales para los periodos de hibernación, por lo que su asociación con pa- rámetros antropométricos se ha explorado en algunas investigaciones [62]. Amstrup et al. describieron una disminución significativa dela masa grasa y un aumento significativo de la masa magra en mujeres posmenopáusicas suplementadas con melatonina [63]. Igualmente, Szewczyk-Golec et al. observaron que la suplementación con melatonina facilita la reducción de peso en pacientes con obesidad, y regula la secreción de adipoquinas [64]. Se ha propuesto que el efecto de la melatonina en la reducción de la masa grasa resulta del aumento en la cantidad y actividad del tejido adiposo marrón [65,66]. Asimismo, se ha descrito una relación positiva entre los niveles urinarios de melatonina y la fuerza muscular así como una relación de esta hormona con la prevención de la sarcopenia [67,68]. Varios estudios sugieren una función reguladora de la melatonina en la diferenciación de células madre mesenquimales al inhibir la adipogénesis y estimular la osteogénesis, presuntamente, al suprimir la expresión de PPAR gamma y aumentar la expresión de Runx-2 [69].

En cuanto a la ingesta alimentaria, se pudo establecer correlaciones positivas de la ingesta de proteínas con el AUC de melatonina. Se resalta que el triptófano, un aminoácido esencial contenido en las proteínas de la dieta, es precursor para la síntesis de serotonina, que posteriormente es convertida en melatonina a partir de procesos enzimáticos [70]. Se ha evidenciado que la suplementación con triptófano al desayuno aumenta los niveles de melatonina nocturna [71,72].

Como principal fortaleza de esta investigación se destaca el seguimiento de varios parámetros en un mismo sujeto, con historial de trabajo por turnos, sometido a cambios de horario laboral que interfieren en su exposición al ciclo luz y oscuridad; lo anterior aporta una metodología distinta a la comúnmente utilizada en la que se agrupan y comparan a los trabajadores por turnos con trabajadores diurnos. Es la primera investigación, hasta donde se tiene conocimiento, en reportar niveles de melatonina en trabajadores por turnos en Suramérica. Los hallazgos aquí descritos representan un aporte al conocimiento sobre niveles circulantes de leptina en trabajadores por turnos y además, sugieren una posible relación entre melatonina endógena y parámetros antropométricos, poco descritos en la literatura disponible. Sin embargo, es importante considerar que esta investigación se llevó a cabo con una muestra de tamaño pequeño y en una sola rotación laboral; estudios con mayor cantidad de sujetos y un tiempo más prolongado de seguimiento podrían aportar mayor información sobre el trabajo por turnos, los niveles de melatonina y su posible relación con el riesgo de padecer enfermedades crónicas no transmisibles.

El seguimiento de los individuos durante su rotación laboral permitió evidenciar que durante el turno nocturno, los trabajado- res consumieron más calorías y tuvieron mayor glucemia, situaciones que pueden incrementar la susceptibilidad a desarrollar obesidad y diabetes.

Conflictos de interés: las autoras declaran no tener ningún conflicto de interés.

Fuentes de financiación: financiado a partir de la convocatoria nacional para el apoyo a proyectos de investigación y creación artística de la Universidad Nacional de Colombia (Código QUIPU 201010029003). La institución financiadora no tuvo influencia en el protocolo de estudio ni en la preparación del manuscrito.