Detecci e identificaci de Streptococcus agalactiae en gestantes: aspectos relevantes y revisi narrativa de la literatura

Espectro de la infecci por SGB

Aunque las manifestaciones más severas de la infecci se han observado en los neo-natos y gestantes, existen otras poblaciones en riesgo, como los mayores de 60 as y los pacientes inmunosuprimidos [1]. En mujeres embarazadas la infecci en la placenta desencadena una respuesta inflamatoria, que puede causar corioamnionitis (13 %) [31], retraso en el crecimiento intrauterino (17 %), parálisis cerebral a nivel fetal (4 %) [32], endometritis posparto (9 %) [33], sepsis materna, abortos espontáneos y muerte fetal (10 %) [34]. En los mayores de 60 as, la bacteria causa celulitis, abscesos, infecciones plantares o ceras de decito y manifestaciones sistémicas como bacteriemias y septicemias [1]. En adultos la manifestaci clínica más com es la bacteriemia en un 18 % de los casos, seguido de artritis, celulitis, meningitis, osteomielitis y endocarditis; principalmente en pacientes con condiciones de base, tales como diabetes, alcoholismo y enfermedad renal crica [35,36]. En pacientes inmunosuprimidos, la bacteriemia es la mayor causa de morbimortalidad. También se han reportado casos de endocarditis, infecciones en piel y tejidos blandos e invasiones al sistema nervioso central en porcentajes menores del 2 % [35]. En Colombia se ha reportado una incidencia de 0.75 x 1000 en adultos inmunosuprimidos, principalmente afectados con bacteriemias e infecciones de piel y tejidos blandos [36].

Microbiología, tipos capsulares y subtipos del SGB

El SGB es un coco grampositivo beta hemolítico que tiene el antígeno polisacárido específico de la pared celular del grupo B seg la clasificacin de Lancefield [37]. La bacteria tiene 10 serotipos capsulares diferentes (Ia, Ib, II a IX), los cuales pueden ser identificados mediante ensayos moleculares o pruebas de aglutinaci en látex [37]. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la cápsula confieren protecci contra la enfermedad, por lo que la tipificaci capsular del SGB genera informaci importante para conocer el efecto de la implementaci de la vacuna, la cual se encuentra en fases avanzadas de desarrollo [38]. La distribuci de los diferentes serotipos en todo el mundo y por regiones geográficas se presenta en la Tabla 2 [39].

Aunque no se ha establecido una asociaci determinante entre los serotipos y el tipo de infecci o sensibilidad antibiica, algunos se encuentran más frecuentemente como colonizantes (V) o causando infecciones invasivas (Ia, II, III). Los tipos Ia, II, III y V son los más prevalentes en América, Europay África, mientras que en Asia se reportan, además, el VI, VII y VIII. El tipo capsular IV se ha encontrado en incremento y se considera emergente.

El estudio molecular de la estructura poblacional de la bacteria utilizando tipificaci multilocus de secuencias (MLST) y secuenciaci genica, ha identificado diversos linajes o subtipos (ST) y particularmente el linaje ST17, denominado el clon o tipo hipervirulento, se ha asociado con la sepsis neonatal tardía y meningitis, causando secuelas severas en el infante [39].

El clon hipervirulento (ST17) se ha reportado a nivel mundial y se asocia con el tipo capsular III cuya prevalencia oscila entre el 11 al 25 % [40]. El ST17 posee una adhesina específica (HvgA) que le confiere la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica y también otros factores de virulencia como una proteína mutada rica en serina (Srr2), el aparato de secreci SecA2/Y2 y una variante de la proteína Rib (de la familia alpha-like) [41] que le confieren potencial patogénico diferencial.

Diagntico por el laboratorio del SGB

La muestra recomendada para el tamizaje prenatal es un hisopado vaginorectal tomado entre las 36 0/7 y 37 6/7 semanas de gestaci, considerando que el valor predictivo positivo del cultivo es mayor cuando se toma en el intervalo de las 5 semanas antes del parto [6]. Esta reciente modificaci en las recomendaciones del Colegio Americano de Ginecoobstetricia [6] se realizpara mejorar la predicci de la colonizaci intraparto, dado que solo 60 % de las colonizaciones anteparto persisten en el momento del parto [42] y que más de la mitad (53 % - > 60 %) de los neonatos con sepsis temprana nacen de madres con tamizaje negativo [43]. Para la toma de la muestra se debe usar un hisopo de punta aguda (flocado) que permite una mayor recuperaci de la bacteria y el cual debe introducirse cerca al introito y luego en el esfínter anal [6]. Los hisopos se deben transportar en medio Amies o Eswab, dentro de las 24 horas a la toma de la muestra, de otra forma deben ser refrigerados a 4 °C hasta su procesamiento, se ha observado que la viabilidad de la bacteria se conserva por 2 días a 20 - 25 °C o hasta 4 días entre 2 - 8 °C [44]. Los hisopos deben ser incubados 18 - 24 horas en un medio de enriquecimiento selectivo (pre-enriquecimiento)

o caldo Todd Hewitt (TH) suplementado con gentamicina (8 µg/mL) o colistina (10 µg/mL) y ácido nalidíxico (15 µg/mL) (denominados caldos Trans-Vag o Lim, respectivamente) antes de hacer la inoculaci en agar sangre de cordero (AS) o medios cromogénicos para SGB [6]. Colonias blancas grisáceas con beta hemisis y catalasa negativas en el AS deben ser identificadas de acuerdo con los sistemas disponibles en el laboratorio (Figura 1).

El enriquecimiento se recomienda dado que aumenta hasta dos veces la posibilidad de recuperar la bacteria, no realizarlo puede generar hasta un 50 % de falsos negativos, una reducci en el tiempo del enriquecimiento también afecta la detecci de la bacteria [42,45]. Con el fin de optimizar la detecci se sugiere también realizar un cultivo directo de la muestra en caso de que haya proliferaci de la microbiota durante el enriquecimiento, dado que se ha observado inhibici del SGB por sobrecrecimiento de Enterococcus (Figura 1) [6].

El cultivo tiene varias limitaciones, una de ellas es que se fundamenta en la detecci de colonias con beta hemisis y/o prueba de CAMP positiva (factor Christie, Atkins, and Munch-Peterson presente), no obstante 5 % de las cepas de SGB no son beta hemolíticas y pueden producir enfermedad invasiva [6,46]. Además, el cultivo requiere 24 horas adicionales al enriquecimiento y al menos otras 24 horas para realizar la identificaci y susceptibilidad del microorganismo.

Las técnicas de amplificaci de ácidos nucleicos (NAATs, por sus siglas en inglés) tienen una sensibilidad variable dependiendo de la prueba, pero usualmente es > 96 % comparada con el cultivo (54 - 90 %) y los tiempos de reporte son más cortos. Sin embargo, también requiere el enriquecimiento selectivo

[47] y, en algunos casos, a es necesario el cultivo para determinar la susceptibilidad de la bacteria a clindamicina y eritromicina debido a que, en gestantes alérgicas a la penicilina, la clindamicina es una opci recomendada para la profilaxis.

A pesar de la guía estándar para la toma, procesamiento e identificaci del SGB, existe una pobre adherencia a estas medidas incluso en países de alto ingreso, lo que afecta su diagntico [48]. La detecci de la bacteria es la base para implementar la PAI, detener la transmisi, evitar las terapias no indicadas y prevenir el desarrollo de la resistencia. La mayoría de los neonatos infectados vienen de madres con tamizaje negativo para SGB, lo que sugiere una proporci significativa de falsos negativos por cultivo y/o la colonizaci materna posterior al tiempo de tamizaje y presente en el momento del parto [49]. En gestantes con parto prematuro o sin tamizaje previo, la realizaci de una NAAT rápida ha representado muchos beneficios y, de hecho, se utiliza en países de alto ingreso, no obstante, a no se recomienda como prueba de tamizaje dentro de los protocolos debido a que su valor predictivo negativo es bajo [6].

Diagntico convencional versus diagntico molecular

Dadas las limitaciones del cultivo (estándar de oro), la investigaci se centra en el dise y utilizaci de nuevos métodos diagnticos y de tipificaci. De los artículos seleccionados en la revisi, se encontraron 44 sobre el diagntico: 2 de revisi y 42 enfocados en técnicas diagnticas independientes al cultivo: 34 (80 %) sobre NAATs, incluyendo 24 sobre aplicaciones de la reacci en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y qPCR, uno en PCR digital, 7 en amplificaci isotérmica mediada por bucle (LAMP) y 2 sobre amplificaci mediada por recombinasa y polimerasa (RPA). De los 8 artículos restantes, uno se enfocen la detecci por CRISPR Cas, 2 en secuenciaci para tipificaci capsular, 4 en identificaci por perfil de proteínas (MALDI-TOF) y uno en biosensores. (Tabla 3).

El PCR ha sido la técnica molecular más empleada como alternativa al cultivo, los genes blanco utilizados codifican por proteínas conservadas del SGB, tales como el gen cfb (factor CAMP), atr (proteína transportadora de la glutamina), sip (proteína inmunogénica de superficie), sodA (superido dismutasa), scpB (C5a peptidasa) o ARNr 16S, siendo los blancos más comunes el gen cfb, el atr y el ARNr 16S. El gen cfb codifica por la hemolisina encontrada en la mayoría de los aislados [37], exceptuando los aislados CAMP negativos que presentan deleciones de este gen gen [47]. El gen sip que codifica por la proteína generando resultados falsos negativos [50] inmunogénica de superficie es altamente con-y disminuyendo la efectividad de este blanco servado, esta proteína se encuentra expuesta para la detecci de la bacteria. El gen atr ha en la superficie de todos los serotipos del SGB. sido reportado como el de mayor rendimiento Escobar et al. validaron un qPCR cuyo blanco por algunos autores [47,51] los cuales sugie-fue el gen sip con un límite de detecci entre ren que, cuando se utilice como blanco de 2 a 5 fg/µL de ADN y correlaci del 100 % amplificaci el gen cfb, se debe incluir otro con el cultivo [52].

Recientemente se ha disedo un qPCR cuyo blanco incluye dos regiones cromosomales del SGB, una regin que codifica por una proteína glicosil-transferasa (GTFP) y una regi del regulador transcripcional LysR, el propito de esta técnica es subsanar las limitaciones de la PCR cuyo blanco es solo el gen cfb [50].

La mayoría de los estudios encontrados compararon el PCR convencional y el qPCR con el cultivo y las pruebas fenotípicas. La sensibilidad del PCR se ha observado hasta en un 100 % con un 87.1 % de especificidad, estos valores varían de acuerdo con el tipo de prueba [6], como se observa en la Tabla 3. En general, el PCR presenta mayor sensibilidad y especificidad que el cultivo, y el formato en tiempo real ha demostrado ser más rápido, sensible y con un límite de detecci > 40 UFC/mL en comparaci con el PCR convencional [54].

Las pruebas moleculares generan resultados en menor tiempo, pueden automatizarse y procesar simultáneamente mtiples muestras [45], por lo que algunos autores sugieren que sea el nuevo estándar de oro [18,50,54]. Sin embargo, para realizar el PCR también es necesario incluir el enriquecimiento en caldo TH suplementado, con el fin de aumentar su sensibilidad entre un 33 – 63 % para los cebadores atr y entre 44.4 – 54.5 % para los cebadores cfb [47].

El PCR se ha acoplado a plataformas automatizadas de extracci, amplificaci y detecci del ADN en tiempo real, tales como el BD Max (Beckton Dickinson), Cepheid Smart GBS, Xpert GBS, Xpert GBS LB, Xpert GBS LB XC, Xpert Xpress (Cepheid), Illuminege system (Meridian Bioscience), Aries GBS (Luminex), IDI-Strep B (Infecto Diagnostics), AMPLIVUE GBS (QUIDEL) y GenePOC GBS LB, las cuales detectan el gen cfb (Tabla 3). Un ejemplo es el BDMax GBS que amplifica el gen cfb con sensibilidad de 200 UFC/mL y que en 2 horas puede procesar hasta 24 muestras simultáneamente [60]. Algunas pruebas comerciales pueden realizarse directamente en las muestras como prueba rápida directa (sin enriquecimiento) y a pesar de que generan falsos negativos, su rendimiento es equivalente al del cultivo [42]. A pesar de su utilidad potencial, las pruebas directas intraparto a no se recomiendan como reemplazo del tamizaje anteparto debido a que no hay suficiente informaci que respalde su uso de rutina. Estudios previos no aleatorios no encontraron un beneficio estadísticamente significante cuando comparan las pruebas rápidas intraparto y el cultivo, no obstante, se necesitan estudios aleatorios para evaluar este aspecto [63]. A pesar de su sensibilidad variable, las pruebas comerciales directas son consideradas de utilidad en un tamizaje rápido [6,56]. Actualmente, el mejoramiento de las plataformas para pruebas rápidas intraparto es uno de los objetivos de desarrollo en cuanto a la detecci de la bacteria en gestantes [78]. Las pruebas rápidas entre sí tienen efectividad similar, aunque algunas ofrecen mayor flexibilidad y formatos simples que no requieren personal entrenado. Un ejemplo es el GenomERa que se ha descrito como un sistema muy simple y que puede ser aplicado fácilmente en el punto de atenci [65,79].

Los métodos de extracci de ADN también pueden impactar la sensibilidad y especificidad del PCR; Schrner et al. [80] observaron que la extraccin utilizando guanidina 5M tenía una sensibilidad y especificidad de 100 y 86.5 %, respectivamente, mientras que la utilizaci de un estuche comercial tuvo una sensibilidad y especificidad del 50 y 95 %. Lo anterior sugiere que el rendimiento del PCR incluso puede optimizarse a nivel de la extracci. Recientemente se ha desarrollado un PCR digital de tercera generaci que puede detectar hasta 5 pg/µL de ADN, este método ultrasensible permite la cuantificaci de ADN, pero todavía no está disponible comercialmente [58]. El PCR digital diluye y divide la mezcla de reacci y la distribuye en microgotas, las cuales son amplificadas en reacciones independientes, el rendimiento es parecido al del qPCR y se ha utilizado en la cuantificaci de patenos. Otras versiones del PCR permiten la diferenciaci de los tipos capsulares del SGB, lo cual es importante para la vigilancia epidemiolica, evaluacin de vacunas y la identificaci de los tipos más virulentos en neonatos, tales como los tipos Ia, Ib y III [81,82].

Aunque el qPCR es muy sensible y genera resultados en pocas horas, a requiere de equipo especializado, preparaci de la muestra y personal entrenado, haciéndolo menos versátil para ser una prueba rápida o de punto de atenci del paciente. Una alternativa es el LAMP, otra NAAT ampliamente utilizada para diagntico con formatos simples y cualitativos de alta sensibilidad y especificidad [66]. Esta técnica puede ser manual, semiautomatizada o automatizada y se ha aplicado en la detecci del SGB utilizando genes blanco diferentes al cfb, particularmente el sip, con una sensibilidad del 87 % comparada con el cultivo, y del 100 % comparada con el PCR [70,71] y con una especificidad entre el 81 – 100 % [66,71]. Se han reportado pruebas LAMP con límites de detecci de 1 pg de ADN [68] y procesamiento entre 45 - 80 minutos [67].

Otra NAAT isotérmica utilizada es la RPA, la cual es altamente sensible y selectiva, requiere de una preparaci mínima de la muestra y amplifica de 1 a 10 copias de ADN en menos de 20 minutos. Básicamente, los cebadores se combinan con una recombinasa que identifica la regi blanco para que luego una proteína de uni al ADN monocatenario permita que se integre una polimerasa que amplifica el fragmento. Para la detecci de genes cfb y sip se ha reportado una concordancia del 100 % con el PCR y el cultivo [74] con límite de detecci de 6.000 copias y procesamiento de 4 h 20 minutos, también se han descrito pruebas RPA para discriminar bacterias viables [73].

La mayor limitaci de las NAATs para la detecci del SGB es que se requiere una prueba adicional para determinar la sensibilidad a clindamicina y eritromicina. Otaguiri et al. desarrollaron un qPCR mtiple para detectar los genes ermA, ermB que codifican por metilasas ribosomales y mefA/B codificante de las bombas de flujo, los cuales confieren resistencia a macridos y lincosamidas [55]. Sin embargo, el PCR mtiple solo está estandarizado para ser realizado a partir de las colonias del SGB debido a que otras bacterias pueden tener los mismos genes de resistencia, generando así falsos positivos si se hace directamente de la muestra.

Técnicas novedosas diferentes a las NAATs también han sido descritas, como por ejemplo, el CRISPR-GBS utilizada por Yu et al. para la detecci del gen cfb con una sensibilidad y especificidad > 96 % y un tiempo de procesamiento de 35 minutos sin enriquecimiento [75]. Otro ejemplo es el análisis de perfiles protéicos diferenciales (subunidad 28s del RNA ribosomal) mediante el MALDI-TOF que identifica la bacteria con una sensibilidad del 100 % y especificidad del 88 % (en referencia con el cultivo) detectándola directamente del medio de enriquecimiento sin subcultivo [77]. El MALDI-TOF se ha descrito como una técnica rápida, simple y de fácil adaptaci al diagntico microbiolico [76]. Este método se ha utilizado para discriminaci de tipos capsulares, linajes y del clon hipervirulento en aislados de diferentes fuentes [19].

Recientemente, Alsheim et al. utilizaron un sistema basado en un sensor que incluye una vesícula de fosfolípidos y ácidos grasos acoplados con carboxi-fluoresceina que puede ser lisada por los factores de virulencia de la bacteria con una sensibilidad del 83.3 % y especificidad del 85.7 % y con un tiempo de proceso de 45 minutos [83], con la ventaja de que esta técnica puede detectar bacterias viables.

Financiamiento: Ninguno.

Apoyo tecnológico: Los autores informan que no usaron Inteligencia Artificial, o tecnologías similares en la elaboraci o edici de este documento.

Contribución:Ambos autores contribuyeron en el dise, análisis, redacci y revisi del manuscrito.