DIAGNÓSTICO IN VITRO DE LA DEFICIENCIA LCHAD

José Henry Osorio¹ PhD

¹ Profesor Titular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. Correo: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co.

RESUMEN

Objetivo. Analizar la oxidación de sustratos deuterados en fibroblastos de pacientes que sufren deficiencia de hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (LCHAD).

Materiales y métodos: fibroblastos de pacientes y controles se incubaron con ácido palmítico  deuterado y  se determinaron los intermediarios de la oxidación del mismo en nmol/mg proteína/72 horas

Resultados: Las concentraciones observadas para los diferentes ácidos grasos, permiten diferenciar los fibroblastos de pacientes con  deficiencia de LCHAD de los fibroblastos controles

Conclusión: Esta técnica permite el diagnóstico in vitro de la deficiencia de hidroxi-acil-CoA de cadena larga.

Palabras clave: metabolismo energético, ácidos grasos, diagnóstico precoz.

Arch Med (Manizales) 2013; 13(1):24-30

IN VITRO DIAGNOSIS OF LCHAD DEFICIENCY

SUMMARY

Objective: to analyse the oxidation rate of tritiated substrates in fibroblasts of patients suffering the deficiency and controls.

Materials and methods: fibroblasts from patients and controls were incubated with deuterated palmític acid and the metabolites of the oxidation of this substrate were measured in nmol/mg proteína/72 hours.

Results: the observed concentrations for different fatty acids, enable us to differentiate fibroblasts of patients suffering LCHAD deficiency from normal fibroblasts.

Conclusion: A characteristic profile for this deficiency was found using this technique which its in vitro diagnosis.

Keywords: energy metabolism, fatty acids, early diagnosis.

INTRODUCCIÓN

La β-oxidación mitocondrial, es el proceso mayoritario de oxidación de los ácidos grasos, siendo una fuente energética muy importante tanto para el  músculo esquelético como para el músculo cardiaco, principalmente durante los períodos de ejercicio prolongado y durante el ayuno.  Una vez al interior de la mitocondria, los ésteres acil-CoA de los ácidos grasos son degradados a través de cuatro reacciones secuenciales a saber: a. Reducción en la posición  a-b del acil-CoA produciendo 2,3,-enoil-CoA.  b. Hidratación del doble enlace dando lugar a especies estereosespecíficas, L-3-hidroxiacil-CoA. c. Oxidación en la posición 3-hidroxi dando lugar a 3-cetoacil-CoA. d. Rotura tiolítica del 3-cetoacil-CoA a acetil-CoA y acil-CoA, cuya cadena carbonada es ahora dos átomos de carbono más corta. Este acil-CoA puede volver a entrar en el ciclo de la ß-oxidación, tantas veces como sea necesario, hasta su completa oxidación a acetil-CoA. Se ha descrito un complejo de la membrana interna mitocondrial  (llamado "proteína trifuncional"  TFP) que realiza las tres actividades enzimáticas enoil-CoA hidratasa, hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, y cetoacil-CoA tiolasa, pasos b, c, y d de la β-oxidación mitocondrial, para los ácidos grasos de cadena larga¹.  La deficiencia de 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD) sola, o como parte de la deficiencia de proteína trifuncional (TFP), se manifiesta típicamente durante los episodios de ayuno o enfermedad, como hipoglicemia hipocetócica. Las complicaciones agudas o crónicas de la deficiencia de LCHAD, pueden ser manejadas evitando el ayuno y consumiendo una dieta baja en ácidos grasos de cadena larga y muy larga, así como suplementado a los pacientes con ácidos grasos de cadena media y corta ². La deficiencia de LCHAD es rara y puede ser causada por mutaciones en la subunidad alfa (OMIM # 600890), o en la subunidad beta (OMIM #143450), de la TFP, siendo la mutación de cambio de sentido c.1528G>C en la subunidad alfa la más prevalente ^3,4. El presente estudio analizó la oxidación de sustratos deuterados en fibroblastos de pacientes con deficiencia de LCHAD como herramienta diagnóstica para este tipo de alteraciones metabólicas.

MATERIALES Y METODOS

El presente estudio es de tipo experimental descriptivo. El material biológico empleado en el presente estudio ha sido fibroblastos de 2 pacientes con  deficiencia de LCHAD. Esta deficiencia fue  confirmada por estudios enzimáticos, moleculares, o ambos. Como controles se utilizaron 20 cultivos diferentes de fibroblastos normales.

Como sustrato fue empleado el Acido ² H₃-metil-palmítico (Cambridge Isotope Laboratories). Fueron utilizados los siguientes compuestos deuterados  para la preparación de la curva de calibración (Ten Brinx-Free University Amsterdam): [8,8,8-d₃]octanoil-L-carnitina.HCl,[10,10,10-d₃]decanoil-L-carnitina.HCl, [12,12,12-d₃]dodecanoil-L-carnitina.HCl, [14,14,14-d₃]tetradecanoil-L-carnitina.HCl, [16,16,16-d₃]hexadecanoil-L-carnitina.HCl.

Como estándar interno fue adicionado ácido undecanodióico (Fluka), durante el proceso de extracción de las muestras.

Fibroblastos de pacientes y controles: (4-20 pasajes) fueron cultivados en bicarbonate-HEPES-buffered Eagle’s minimal essential médium (MEM), suplementado con 10% (v/v) newborn calf serum, y 1% (v/v) de antibiótico (gentamicina) a  37⁰C, en estufa con 5%CO₂/95% de aire. Después de alcanzar el punto de confluencia (80-100%), las células fueron lavadas dos veces con PBS y la solución se tripsinizó  (1 ml de tripsina-EDTA a 37⁰C), y posteriormente se neutralizó mediante la adición de 3-5 ml de MEM (Minimun Esential Medium). Las células fueron  transferidas y centrifugadas a 337 X g (5 min, 20^oC) en  tubos cónicos de 10 ml (0.8-1.2 mg proteína), quedando listas para ser incubadas en presencia de sustratos  deuterados. Se utilizó el método de Lowrry y Col. ⁵, para la determinación de la proteína. Para la oxidación ²H₃-palmítato en fibroblastos fue utilizada la técnica diseñada por Osorio y cols ⁶; se preparó una solución de medio de cultivo con una concentración final de 0.15 mM  de ácido 16-²H₃ palmítico, 1mM BSA, y 0.2 mM L-carnitina.  La incubación por los fibroblastos se llevó a cabo de la siguiente manera: después de la tripsinización, las células fueron resuspendidas en MEM enriquecido en frascos falcom de 2,5 ml (2 frascos por caso). Después de 72 horas de incubación, el medio de cultivo fue recogido mediante centrifugación y almacenado a –20⁰C hasta su análisis. Las células se resuspendieron en 1 ml de PBS1 para proceder a la determinación de proteínas.

El análisis cuantitativo se basó en el método del estándar interno. Se prepararon curvas de calibración para  los ácidos grasos C₈, C₁₀, C₁₂, y C₁₄, en un rango de 0 a 150 nM, y C₁₆  en un rango de 0-1000 nM, utilizando acilcarnitinas deuteradas en el último carbono, diluidas en MEM (p< 0.00001 para cada curva de calibración). El análisis de los ácidos grasos de los medios enriquecidos (curvas de calibración y  productos de la incubación) fue realizada después de la hidrólisis con KOH. Las curvas de calibración se obtuvieron mediante el análisis de la regresión lineal, representando la relación de concentraciones de cada ácido respecto al estándar interno frente a la relación de áreas. Las condiciones de la cromatografía gas-líquido fueron las siguientes: flujo de gas portador (He): 1 ml/min; división de flujo: 1:30; tiempo de spitless: 1min 5 segundos; temperatura del inyector: 250 ⁰C; temperatura del horno y programación de temperaturas: T1 70⁰C a 6⁰C/min, T2 250 ⁰C  a 20 ⁰C/min hasta T3 300 ⁰C; volumen de inyección: 1ml;  tiempo total: 38.5 min. Las condiciones de la espectrometría de masas fueron las siguientes: el análisis cualitativo se realizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas, con impacto electrónico y monitorización selectiva de iones. Para cada ácido se monitorizó el ión M⁺-15, ya que es el ión selectivo y uno de los más abundantes; la ionización se realizó por impacto electrónico a 70 eV  y la fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 200 ⁰C. La temperatura del analizador fue de 100 ⁰C; para la adquisición de datos, el instrumento utilizó un scanning repetitivo en un rango de 40 a 600 unidades de masa atómica. Fue utilizado un cromatógrafo de gases 5890 Series II Plus – Espectrómetro de masas 5972 Series (Hewlett Packard).

De acuerdo con el artículo 11 literal a. de la Resolución No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud de Normas Científicas, Técnicas, y Administrativas para la Investigación en Salud, el presente estudio es considerado sin riesgo.

RESULTADOS

En todas las curvas de calibración se obtuvo un coeficiente de correlación superior al 0.99. (C8: y=0.9762x + 10.6; C10: y=1.0129x + 8.6; C12: y=0.9885x + 9.5; C14: y=0.985x + 10.4; C16: y=1.015x + 10.61). La figura 1 muestra los espectros de masas del ácido ²H₃-palmítico (A) y del estándar interno (IS) ácido undecanodióico (B).

Figura 1.   Espectros de masas del ácido ²H₃-palmítico (A) y del estandar interno (IS) ácido undecanodióico (B). Obtenidos del equipo utilizado en el presente estudio.

La  figura 2, muestra el cromatograma de la mezcla de  ácidos grasos deuterados de la curva de calibración, producto de la hidrólisis de las acilcarnitinas deuteradas.

Figura 2.  GC-MS-SIM de la mezcla de  ácidos grasos deuterados de la curva de calibración. Están indicados según el número de átomos de carbono en la cadena así: C8, octanóico; C10, decanóico; C12, dodecanóico; C14, tetradecanóico; C16, hexadecanóico, así como el estandar interno (IS). Obtenidos del equipo utilizado en el presente estudio.

Se obtuvo un perfil característico en los cromatogramas en la deficiencia de LCHAD  y en los controles (figura 3).

Figura 3. GC-MS-SIM de la incubación del ácido ²H₃-palmítico en fibroblastos control y de pacientes con deficiencia de VLCAD. Están indicados los ácidos grasos deuterados según el número de átomos de carbono: C8, octanóico; C10, decanóico; C12:1, dodecenóico; C12, dodecanóico; C14:1, tetradecenóico; C14, tetradecanóico; C16, hexadecanóico. IS identifica el estandar interno. Obtenidos del equipo utilizado en el presente estudio.

Las concentraciones observadas para los diferentes ácidos grasos, permiten diferenciar los fibroblastos de pacientes con  deficiencia de LCHAD de los fibroblastos controles (tabla1). Al realizar análisis estadístico mediante la prueba t de student se encontró diferencia significativa (P<0.05) entre los pacientes y los controles, para el total de ácidos grasos acumulados, con incrementos significativos de C12, C14 y C16:OH.

Tabla 1. Producción de ácidos grasos deuterados en fibroblastos control y de pacientes con deficiencia de LCHAD, posterior a la incubación con ácido ²H₃-palmítico.

Línea Celular			Ácidos grasos intermediarios (nmol/mg proteína/72 h)
	C8	C10	C12:1			C12	C14:1	C14		C16:1		C16:OH		Total
Controles Intérvalo	16,7 (5,8-28,6)	10,4 (7,8-14,3)	0,8 (0,3-1,3)			5,2 (1,0-17,6)	4,1 (2,8-5,7)	9,2 (2,8-25)		16,9 (11,1-28,6)		nd		63.3 (31.6-121.1)
LCHAD	18	12,3		0,8	38,6		3,9		32,9		38,6		97		232.1

Abreviaturas: nd, no detectado

DISCUSION

El diagnóstico de la deficiencia de hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga se basa en las manifestaciones clínicas, tales como hipoglicemia, hepatomegalia, cardiomiopatía, trastornos del ritmo cardíaco, debilidad muscular o miopatía,  principalmente⁷. También se han reportado síndrome de muerte súbita del lactante, retinitis pigmentosa, neuropatía periférica, y mioglobinuria^8,9.  Las investigaciones bioquímicas demuestran niveles bajos de carnitina en sangre, así como niveles elevados de C_14:1n-9 en suero, y elevación de hidroxiacilcarnitinas en sangre (C_16:OH, C_18:OH, C_18:1OH) ¹⁰. Los estudios “in vitro” de estos pacientes incluyen la utilización de fibroblastos y linfocitos entre otros ¹¹. En la   deficiencia de LCHAD encontramos elevación en los niveles de C12, C14 y niveles de C16:1; además se detectó C16:OH. Todo esto concuerda con otros trabajos que hacen referencia al perfil de acilcarnitinas para estas dos deficiencias ^{12, 13, 14}.  En la deficiencia LCHAD un porcentaje de intermediarios hidroxilados (entre C12 y C18) es retenido intracelularmente en mayor cantidad que los intermediarios no hidroxilados de similar longitud en la cadena de átomos carbono, debido a que en esta deficiencia, existen suficientes cantidades de SCHAD para metabolizar desde C10, hasta C12 parcialmente, pero no para metabolizar cadenas de mayor longitud completamente a ^{15, 16}. Esto implica que las hidroxiacilcarnitinas de cadena larga son substratos menos eficientes que  los intermediarios no hidroxilados para salir de la mitocondria, o de la célula, o de ambos ¹².

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